eingereicht von Justin Schmitz aus Hilden
Erstgutachter: Prof. Dr. Lutz Schmitt; Institut für Biochemie, Abteilung für Membrantransport; Heinrich-Heine Universität, Düsseldorf
Zweitgutachter: PD Dr. Ulrich Schulte; Institut für Biochemie, Arbeitsgruppe Mitochondrienbiogenese; Heinrich-Heine Universität, Düsseldorf
Zusammenfassung
ABC-Transporter sind primär aktive Transporter, deren Aufgabe in der Regel darin besteht, unter dem Transport unterschiedlicher Substrate über biologische Membranen zu kanalisieren. Für die ATP-Bindung und Hydrolyse liegen überzeugende Modelle vor die durch strukturelle und funktionelle Daten gestützt werden. Der Transport hingegen ist weitgehend unverstanden. In der vorliegenden Arbeit sollte daher ein System etabliert werden, um der Substratbindungsstelle des MDR-Exporters LmrA aus L. lactis zu charakterisieren, wodurch tiefergehende Einblicke in den Transportprozess möglich wäre.
Die vorliegende Arbeit unterteilt sich in zwei wesentliche Bereiche. Zum Einen die Homologiemodellierung von LmrA auf Basis der Struktur des ABC-Transporters Sav1866. Zum Anderen die Etablierung der Expression von LmrA, welches mit unnatürlichen Aminosäuren markiert ist. Hierzu wurde ein von der Gruppe von Professor Schultz (Scripps Research Institute, La Jolla, California USA) entwickeltes System zur Erweiterung des genetischen Kodes verwendet.
Auf Grundlage der signifikanten Homologie der beiden ABC-Transporter LmrA und Sav1866 wurde ein Homologiemodell für LmrA erstellt, welches biochemische Daten bezüglich Topologie und Funktion schlüssig erklären kann. Die in der Literatur wichtigsten Aminosäuren für die Transportfunktion von LmrA, aber auch seines humanen Homologen P-gp (ABCB1), liegen in der Transmembranhelix 6. Die TM6 ragt im Homologiemodell in den Hohlraum zwischen den beiden Hälften des Transporters. Diese exponierte Lage unterstreicht die Bedeutung für den Transportprozess von LmrA. Auf Grund dessen wurde die Suche nach der Substratbindungsstelle von LmrA in der TM6 begonnen. Hierzu wurden entlang der gesamten Helix 16 Positionen für Mutanten gewählt, die helfen sollten die Substratbindungsstelle mit spektroskopischen Verfahren zu lokalisieren.
Für die Untersuchungen der Substratbindungsstelle von LmrA sollte das Protein spezifisch mit unnatürlichen Aminosäuren modifiziert werden. Um dies zu realisieren, wurde die Expression von LmrA in E. coli etabliert, da nur für diesen Organismus das System zum Einbau unnatürlicher Aminosäuren durch Amber Stopp Kodons zur Verfügung stand. Im Anschluss wurden die Mutanten in der TM6 erzeugt und ihr Expression gezeigt. Abschließend wurden die Grundzüge einer Reinigung des modifizierten Proteins etabliert.
Zusammenfassend hat diese Arbeit die Grundlagen für die gezielte Untersuchung der Substratbindungsstelle des ABC-Transporters LmrA aus L. lactis geschaffen und stellt die Basis für eine Vielzahl von Experimenten zum Verständnis des Transportprozesses von LmrA dar.
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